Fue asignado al colegio de Santa Cruz en Tlaltelolco, cerca de la Ciudad de México, y asumió las tareas de predicar, convertir e instruir a los jóvenes nativos, en español y latín, acerca de las ciencias, la música, y la religión, en tanto que, mediante el estudio concienzudo y años de práctica, logró un dominio tal de la lengua azteca como nadie más lo ha logrado desde entonces. Aunque desempeñó en varias oportunidades funciones administrativas, él prefería dedicar su atención únicamente al trabajo de enseñanza e investigación.

Su dedicación y gran capacidad para el lenguaje y la religión de los indios atrajeron la atención de su superior, quien le ordenó preparar, en el lenguaje Azteca, un compendio de todo lo relacionado con la historia y las costumbres nativas que pudiera utilizarse para el trabajo de cristianizar a los indios. Esta tarea le tomó alrededor de siete años, con la colaboración de las mejores autoridades nativas, siendo expandida en una historia y descripción de la gente y civilización Aztecas, en doce libros manuscritos, junto con una gramática (Arte) y un diccionario del idioma.

Diversos retrasos le permitieron al autor continuar las revisiones y los agregados durante varios años. Uno de tales retrasos tuvo que ver con el tema de la contratación de ayuda para este trabajo, por considerarse contrario al voto de pobreza Franciscano, aunque el Padre Sahagún, debido a su edad y el temblor de su mano, estaba imposibilitado de escribir.

Luego de cinco años de espera, finalmente la decisión fue a favor del autor, quien recibió la ayuda necesaria, concluyéndose el manuscrito Azteca completo con la gramática y el diccionario, en 1569. Mientras tanto, un borrador del manuscrito preliminar había sido llevado a España, donde fue de conocimiento de Ovando, presidente del Consejo de Indias, a cuya solicitud el Delegado General Franciscano requirió al Padre Sahagún la preparación de una traducción completa al español, otorgándosele todo el apoyo necesario. Debido al temor de alentar entre los nativos con algún nivel de instrucción el regreso a su pasado pagano – un peligro muy real en esa época – y también a causa de las críticas del autor a los métodos de los Conquistadores, no fue publicado, sino consultado bajo su forma de manuscrito, siendo enviado de un colegio a otro, dentro de la orden, hasta que finalmente fue llevado a España y depositado en el convento de Tolosa, donde fue encontrado, y copiado por el archivista Muñoz poco antes del año 1800. Fue publicado en 1829 en México, en tres volúmenes, bajo el título de "Historia general de las cosas de Nueva España", y en los tomos cinco y siete de Kingsborough's "Mexican Antiquities", Londres, 1831.

El Padre Sahagún describe así el inicio del trabajo: "Mi superior me ordenó dentro de la santa obediencia, escribir en la lengua Mexicana aquello que me pareciera útil para la doctrina, adoración y el mantenimiento del Cristianismo entre estos nativos de la Nueva España, y para apoyar a los ministros y trabajadores que les enseñaban. Habiendo recibido esta orden, preparé en español un acta o memorando sobre todos los temas que yo tenía que tratar, los cuales son lo escrito en los doce libros... que se iniciaron en el pueblo de Tepeopulco... Reuní a todos los principales, junto con el señor del lugar, a quien se conocía como Don Diego de Mendoza, de gran distinción y habilidad y con mucha experiencia en cosas de lo eclesiástico, militar, político, e incluso lo relacionado con la idolatría. Estando todos reunidos, les expliqué lo que me proponía hacer y les supliqué que designaran a personas capaces y experimentadas con quienes yo podría conversar y entenderme respecto a lo que me interesaba. Me respondieron que conversarían entre ellos y me darían su respuesta en otra oportunidad; y con esto empezaron a retirarse. Así que en otro día, el señor y sus principales vinieron y habiendo conversado entre ellos, con gran solemnidad, como se acostumbraba en aquellos tiempos, escogieron a diez o doce de los principales ancianos, y me dijeron que con ellos yo podría comunicarme y que ellos me informarían sobre los temas que yo le preguntara. De estos hombres, había cuatro que conocían el latín, a quienes yo, unos años antes, les había enseñado gramática en el colegio de Santa Cruz en Tlaltelolco. Con estos hombres designados, incluyendo los cuatro que conocían la gramática, hablé muchos días durante dos años, siguiendo el orden del acta que yo había preparado. De todos los temas que hablamos, ellos me dieron imágenes – que eran la forma de escribir que antiguamente ellos tenían – y estas me las interpretaron los gramáticos en su idioma, escribiendo el significado al pie de la imagen".